獲取連接

 

要想測定神經(jīng)元中的電荷變化，最常用的方法是在培養(yǎng)皿中將金屬電極插入大腦切片中，或者直接插入活體動物的大腦，這種方法已經(jīng)被研究員使用了50余年。長期以來，波士頓大學醫(yī)學院藥理學教授David Farb等研究者也在逐步擴展這些方法的潛力?！拔以缦乳_始進行電生理學研究時，使用的是真空管放大器?！盕arb解釋道，“一名研究員可能要花一整天才能得到一個細胞的記錄，而且可能第二天毫不奏效，因此推進得很慢?！?

 

經(jīng)過一系列長期的改良，F(xiàn)arb和他的同事現(xiàn)在可以在動物正?；顒拥耐瑫r完成整個腦部區(qū)域的活性檢測。盡管這一工作仍然冗長乏味。

 

每次實驗，F(xiàn)arb的實驗室都要制作一種多層設備。首先，他們要將四個電極裝入一個稱為 “四極管”的設備，大約相當于一個人頭發(fā)絲的直徑。德國吉森的Thomas Recording公司和位于佛羅里達州阿拉楚阿的Tucker-Davis科技公司，銷售預制的四極管和相關設備，但是資源有限無法購買這類設備的研究者通常會自己制作這些設備。Farb解釋說，他有一個小車間，其中全是本科生在不斷地制作這種一次性的四極管，“因為我們買不起這些” 。

 

然而，無論是購買還是制作四極管，使用起來都需要耐心，以及如做手術般老練的技能。二三十個四極管連接在一個稱為“前置器”的頂部，該裝置包含一組微驅動器（安裝控制四極管的支架）。微驅動器上有一些小螺旋鉆，研究人員每天只能旋進一小段，以避免傷害腦組織。這個過程可以讓四極管緩慢地進入大鼠或其他動物的腦部目標區(qū)域。

 

對于能夠掌控多路復用電極的人來說，它可以產(chǎn)生寶貴的數(shù)據(jù)。Farb的實驗室已經(jīng)追蹤了“位置細胞”的網(wǎng)絡，顯示動物如何在不同環(huán)境中進行導航，該發(fā)現(xiàn)可以闡釋一切，從最基礎的學習機制到老年癡呆癥的發(fā)病機理。

 

不幸的是，由于小鼠體型太小，無法容納這個領域的標準設備，因此在有意識的動物身上進行電極分析一般都會限制于非人靈長類動物，偶爾可以在大鼠身上實現(xiàn)。位于弗吉尼亞州阿什本的霍華德·休斯醫(yī)學研究所Janelia 研究園區(qū)的團隊負責人Joshua Dudman想要改變這一現(xiàn)狀?！拔耶敃r真的去找現(xiàn)已去世的祖父，他曾是一名設計化油器的機械工程師，我們互相交換了一些想法?！盌udman說。

 

位于馬里蘭州貝塞斯達的美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）國家眼科研究所的杰出科學家Robert Wurtz曾為猴子研發(fā)出類似的系統(tǒng)，他提出了一些額外的建議。有了Wurtz的建議，再加上在雞尾酒餐巾紙上畫出的方案，Dudman開始為探究小鼠的大腦制作一個標準的系統(tǒng)。他的團隊使用3D打印機來制造安裝支架，用來固定電極并且保持動物的頭部位置。他們通過與Janelia研究園區(qū)的另一個研究組合作，隨后改良了過去一種基于硅芯片電極矩陣的設計，進而制作出了嚙齒動物體外/體內(nèi)電生理學靶向系統(tǒng)（RIVETS）。正如名字所示，RIVETS利用單一、標準化的組件，就可以研究活體動物或大腦切片。它同時也能利用雙光子顯微鏡來進行同步成像。

 

除了3D打印的部分之外，RIVETS也使用大部分神經(jīng)生物學實驗室都具備的現(xiàn)成儀器。“其中一大問題是你如何將它與儀器的其他部分結合起來。如果我們想要進行準確的定位，我們不想去重新制作顯微操縱器，因為很多不錯的公司已經(jīng)制造出非常高端的產(chǎn)品?！盌udman說。顯微操縱器是經(jīng)過精密加工的設備，通常與顯微鏡平臺連在一起，利用手柄或操縱桿就可以讓研究者移動小組分，例如將電極移入某個位置。

 

科學家可以在Dudman的網(wǎng)站上下載3D打印的文件及其他信息，并且使用來自諸如英國東薩塞克斯郡的Scientifica公司或者加州諾瓦托Sutter公司的顯微操縱器。Dudman接著說，Scientifica公司近期購買了一份非排他性許可證，向傾向于有商業(yè)支持的產(chǎn)品的科研人員銷售成套的RIVETS系統(tǒng)。

 

Dudman并不是唯一一位想要為小鼠打造更好的頭盔的人?！拔覀冊趯嶒炇业闹饕獎?chuàng)新是制作超輕但也超穩(wěn)定版的慢性電生理學植入方式?！?位于羅德島州普羅維登斯的布朗大學神經(jīng)科學副教授Christopher Moore說。

 

對于想要研究小鼠大腦的團隊來說，減輕重量非常關鍵?！安溉閯游锏倪z傳工程和體內(nèi)系統(tǒng)革命是一個巨大的恩賜，但是這都來自于小鼠，它們可是小個子?！盡oore說。他利用新陣列解釋道，“現(xiàn)在你所做的生理學實驗只能在大鼠或猴子身上完成，但已經(jīng)能夠被小鼠更好地適應。”

 

探究大腦

 

無論是用于體內(nèi)或是體外，電極絲一般都能測量神經(jīng)元組織之間的電荷變化。膜片鉗作為一種互補的技術，使用微小的微毛細管來追蹤單個神經(jīng)元中離子通道的波動。

 

對于初次使用膜片鉗技術的人來說，第一步應當回顧基礎電子學?！白瞿てQ的工作，最終你是將神經(jīng)元看作一種電子設備，了解這種電子設備是如何工作的，以及如何在生物學中應用這些原理，我認為這是極其重要的?！倍砜死神R州諾曼的俄克拉荷馬大學生物學助理教授Michael Markham說。Markham正在維護一個稱為“神經(jīng)元的電生理學”的免費軟件包，用于輔助這一過程。

 

在所有電子學的挑戰(zhàn)中，Markham指出，毛細管進入動物腦部越深，它的內(nèi)阻和電容也就越高。這意味著，深部探針與較淺的探針相比，帶寬更少。

 

將毛細管植入膜片鉗實驗的活體動物大腦，所需的操作很棘手，要求特別謹慎的手術技巧。馬薩諸塞州坎布里奇的麻省理工大學（MIT）合成神經(jīng)生物學研究組組長Edward Boyden決定，將這項工作交給機器人來做?！拔覀冄邪l(fā)了一種算法，讓你可以對神經(jīng)元進行膜片鉗操作，并且也可以利用計算機進行自動化操作。無須依靠人的直覺。”Boyden說。

 

Boyden的團隊將該算法用在一個機器人身上，緩慢地將膜片鉗毛細管插入動物腦部的目標區(qū)域，直到檢測到電阻的升高，這就意味著毛細管已經(jīng)遇到了一個神經(jīng)元。隨后，機器人可以附上毛細管，不僅檢測神經(jīng)元中離子通道的活性，還能提取細胞質用于生化分析。

 

在發(fā)表這項技術后，研究人員同時創(chuàng)立了Neuromatic Devices公司，目前銷售自動化的膜片鉗設備，便于他人復制這項技術。Boyden也想要在活體動物中對神經(jīng)生理學的其他方面進行自動化?！拔覀冋J為，我們無意中發(fā)現(xiàn)了人們可以稱為‘活體機器人學’的領域，我們可以在此當中部署一系列的技術，對這種過程進行自動化并提供解決方案?！彼f。

 

同時，Moore的團隊也在試著讓電極生理學變得更便利。Moore 實驗室的研究生Jakob Voigts打造了一批基于開源許可的標準電生理設備。該計劃稱為Open Ephys，讓研究人員可以僅用相當于數(shù)千美元的零件，就能組裝一臺精密的神經(jīng)生理學裝置。在線支持可以幫助使用者解決出現(xiàn)的任何問題。

 

奇思妙想

 

除了讓它更易于檢測神經(jīng)元活性外，Boyden也幫助開拓者在實驗方法上尋找激活神經(jīng)元的新方式。這個創(chuàng)新點源自于他在傳統(tǒng)藥理學和電刺激方法中的失敗，這兩種方法都不是很精確?！澳悴荒苤患せ钜徊糠痔囟ǖ纳窠?jīng)元?！盉oyden說

 

通過檢索文獻，他和同事找到了一條不錯的線索。“2000年春季我們在進行頭腦風暴，我們無意間注意到幾篇所謂微生物視蛋白的文章。” Boyden解釋道。該團隊特別感興趣的一點是感光視蛋白，能夠在光反應下打開微生物細胞膜上的離子通道。當研究者通過遺傳修飾動物的神經(jīng)元去表達其中一個蛋白時，神經(jīng)元開始在光脈沖下展現(xiàn)出活性。自此以后，Boyden的研究組和其他人開始持續(xù)地改進該技術——稱之為 “光遺傳學”，這項技術目前已經(jīng)成為在活體動物和大腦切片中探索神經(jīng)生理學的標準工具。

 

光遺傳學最新的發(fā)展包括對紅光敏感的通道蛋白（能夠深入到大腦組織中），以及光敏感的氯離子通道（能夠在光反應中抑制神經(jīng)元而不是刺激神經(jīng)元）。巧妙的小鼠遺傳技術也使得科學家能將光敏通道的表達限定在非常具體的大腦區(qū)域中。結合這些技術，研究人員目前能夠將光穿過小鼠完整顱骨，并且高度精確地激活或者抑制目標神經(jīng)元群體。Boyden說，“該工具真的已經(jīng)開始得到很常規(guī)的使用?！?

 

光學的戲法也可以進一步探索光遺傳學的可能性。例如，研究人員目前能利用多光子全息圖在動物腦部激活單個的神經(jīng)元?！澳憧梢哉嬲卦囍タ刂粕窠?jīng)編碼中復雜的三維構型，然后這將可以用于檢測神經(jīng)編碼中非常具體的假設?！盉oyden解釋道。

 

同時，光遺傳學也很好地與電生理學相融合。電極絲放置的一大傳統(tǒng)挑戰(zhàn)是找到電極在動物大腦中的位置，利用光遺傳學，研究者現(xiàn)在可以確定這個信息?！爱斈愦蜷_光時，你能夠清楚地看到你利用金屬電極分離的神經(jīng)元是否是（正確的類型）。”布朗大學的Moore說。

 

Moore的實驗室甚至解決了如何結合光遺傳學與另外一項神經(jīng)科學家所鐘愛的工具——功能性核磁共振成像（fMRI）。通過揭示整個大腦的血流變化，fMRI可以給出對刺激反應的概況。光遺傳學現(xiàn)在能夠提供非常準確的刺激。“你能夠在某個特定的點對特定的細胞類型進行刺激，例如說新皮層的手上的代表區(qū)；然后你可以用fMRI去說，‘當我只刺激了該位置的這類細胞時，大腦中還有哪些區(qū)域被激活？’”Moore補充道，“這是非常了不起的信息?！?

 

除了自身的優(yōu)點外，光遺傳學也存在一些缺陷。對于大多數(shù)準確的細胞激活來說，研究者仍然不得不通過顱骨在小鼠大腦中插入光纖。密歇根州芒特普林森的中央密歇根大學神經(jīng)科學副教授Ute Hochgeschwender正在嘗試另一種不同的策略?！氨荛_使用物理光纖的一種方式是，如果我們可以基本上使用一種生物學的光源?！?Hochgeschwender說。

 

Hochgeschwender和她的同事融合了螢火蟲的熒光素酶蛋白與感光視蛋白和熒光蛋白質結構域。得到的熒光視蛋白（luminopsins）在光反應下打開了離子通道，在提供了恰當?shù)臒晒馑孛傅孜飼r可以發(fā)射光線，并在熒光顯微鏡的檢測下發(fā)光。研究人員可通過光照或者向動物注射熒光素底物來激活靶向神經(jīng)元，熒光標簽將揭示哪些細胞正在表達這些蛋白?！叭魏我暤鞍祝魏窝邪l(fā)出的光遺傳學元素，我們都能提供用化學方法得到的另外一個維度?！盚ochgeschwender說。

 

在最近的技術迭代中，Moore和Hochgeschwender正在利用鈣敏感熒光素酶，合作創(chuàng)造一種同時需要底物和鈣離子來激活的系統(tǒng)。發(fā)光使得鈣流向了神經(jīng)元胞漿中，因此“你能夠想象這種系統(tǒng)，在底物存在的情況下，真正的神經(jīng)元活性會打開光亮?！?Hochgeschwender解釋道。

 

然后，研究人員可以鑒定發(fā)光的細胞，甚至是在保持顱骨完好的情況下。Hochgeschwender展望了一種新的策略——科學家在進行實驗前就能夠找到哪只小鼠正在正確的細胞中表達蛋白，排除不恰當?shù)谋磉_模式，從而在實際上減少實驗所需的動物數(shù)目。

 

不過，無論科學家使用電極還是生物熒光酶，與新一代技術打交道的科學家掩飾不住對潮水般涌來的新進展的興奮。就像Farb所說的，“現(xiàn)在我感覺自己像個孩子，我們正在不斷出成果，我就會說，‘哇，我簡直不敢相信這個，我從未想過這個，我從來不敢想像它?！薄?

 

（譯者之一高大海系中國科學院海洋研究所助理研究員）